PCR reaksiýalarynda päsgelçilik faktorlary

PCR reaksiýasy wagtynda käbir päsgelçilik faktorlary köplenç ýüze çykýar.
PCR-iň aşa duýgurlygy sebäpli hapalanmak, PCR netijelerine täsir edýän iň möhüm faktorlardan biri hasaplanýar we ýalan oňyn netijeleri berip biler.
Falsealan-negatiw netijelere getirýän dürli çeşmeler deň derejede möhümdir. PCR garyndysynyň bir ýa-da birnäçe möhüm bölegi ýa-da güýçlendirme reaksiýasynyň özi päsgel berilse ýa-da päsgel berilse, diagnostika barlagy päsgelçilik döredip biler. Bu netijeliligiň peselmegine we hatda ýalan netijelere getirip biler.
Gadaganlykdan başga-da, nusga taýýarlanylmazdan ozal ugratmak we / ýa-da saklamak şertleri sebäpli maksatly nuklein kislotasynyň bitewiliginiň ýitmegi bolup biler. Hususan-da, ýokary temperatura ýa-da ýeterlik däl saklamak öýjükleriň we nuklein kislotalaryň zaýalanmagyna sebäp bolup biler. Öýjük we dokumalary berkitmek we parafin goýmak DNK-nyň bölünmeginiň we dowamly meseläniň belli sebäpleridir (1-nji we 2-nji suratlara serediň). Bu ýagdaýlarda hatda optimal izolýasiýa we arassalama hem kömek edip bilmez.

Surat 1 | Imobilizasiýanyň DNK bitewiligine täsiri
Agarose gel elektroforezi, awtopuslaryň parafin bölümlerinden izolirlenen DNK-nyň hiliniň ep-esli üýtgeýändigini görkezdi. Kesgitleme usulyna baglylykda ekstraktlarda dürli ortaça uzynlykdaky DNK bardy. DNK diňe doňdurylan nusgalarda we buferlenen bitarap formalin bilen saklananda saklanýar. Güýçli kislotaly Bouin düzediji ýa-da päsgelçiliksiz, kislotany öz içine alýan formalin ulanmak DNK-nyň ep-esli ýitmegine sebäp boldy. Galan bölegi gaty bölekleýin.
Çep tarapda bölekleriň uzynlygy kilobase jübütlerinde (kbp) aňladylýar

Surat 2 | Nuklein kislotasynyň nyşanlarynyň bitewiligini ýitirmek
(a) Iki setirde 3′-5 ′ boşluk, maksat DNK-nyň kesilmegine getirer. DNK sintezi henizem ownuk bölekde ýüze çykar. Şeýle-de bolsa, DNK böleklerinde deslapky arassalaýjy ýer ýok bolsa, diňe çyzykly güýçlendirme bolýar. Iň amatly ýagdaýda bölekler biri-birine doýup biler, ýöne hasyl az bolar we kesgitlemek derejesinden pes bolar.
(b) Esasan depurinasiýa we timidiniň dimer emele gelmegi sebäpli esaslaryň ýitmegi, H-obligasiýalarynyň sanynyň azalmagyna we Tm-iň azalmagyna getirýär. Uzaldylan ýylylyk döwründe primerler matrisa DNK-dan erär we has berk şertlerde-de dykylmaz.
(c) Goňşy timin esaslary TT ölçegini emele getirýär.
Molekulýar diagnostikada köplenç ýüze çykýan başga bir umumy mesele, fenol-hloroform çykarmak bilen deňeşdirilende maksatly nuklein kislotalaryň optimal däl çykmagydyr. Iň agyr ýagdaýlarda, bu ýalan negatiwler bilen baglanyşykly bolup biler. Öýjük galyndylaryny gaýnadýan liz ýa-da ferment siňdiriş arkaly köp wagt tygşytlap bolýar, ýöne bu usul köplenç nuklein kislotasynyň ýeterlik bolmazlygy sebäpli PCR duýgurlygynyň pes bolmagyna getirýär.

Güýçlendirmek döwründe polimeraza işjeňliginiň gadagan edilmegi

Umuman, inhibisiýa suboptimal PCR netijelerine getirýän ähli faktorlary suratlandyrmak üçin konteýner düşünjesi hökmünde ulanylýar. Gaty biohimiki manyda, inhibisiýa fermentiň işjeňligi bilen çäklenýär, ýagny DNK polimerazynyň işjeň ýeri ýa-da kofaktory (meselem, Taq DNK polimerazasy üçin Mg2 +) bilen täsirleşmek arkaly substrat-önümiň öwrülmegini azaldýar ýa-da öňüni alýar.
Mysaldaky komponentler ýa-da reagentleri öz içine alýan dürli buferler we ekstraktlar fermenti gönüden-göni saklap ýa-da kofaktorlaryny (meselem EDTA) duzap biler, şeýlelik bilen polimerazany hereketsizleşdirer we öz gezeginde PCR netijeleriniň peselmegine ýa-da ýalňyş netijelerine sebäp bolup biler.
Şeýle-de bolsa, reaksiýa komponentleri bilen maksatly nuklein kislotalaryň arasyndaky köp täsirler “PCR inhibitorlary” hökmünde hem bellendi. Öýjügiň bitewiligi izolýasiýa bilen bozulandan we nuklein kislotasy çykandan soň, nusga bilen onuň töweregindäki ergin we gaty fazanyň arasynda täsirleşme bolup biler. Mysal üçin, “garakçylar” bir ýa-da iki hatar DNK-ny kowalent däl täsirleşmeler arkaly baglanyşdyryp, PCR reaksiýa gämisine ýetjek nyşanlaryň sanyny azaltmak bilen izolýasiýa we arassalanmaga päsgel berip biler.
Umuman alanyňda, PCR inhibitorlary kliniki anyklaýyş synaglarynda (peşewdäki karbamid, gemoglobin we heparin), iýmit goşundylary (organiki komponentler, glikogen, ýag, Ca2 + ionlary) we daşky gurşawdaky komponentler (fenollar) üçin ulanylýan suwuklyklaryň we reagentleriň köpüsinde bar. , agyr metallar)

Has giňden ýaýran PCR ingibitorlaryny bakteriýalarda we eukariotik öýjüklerde, maksatly DNK-da, dokuma matrisalarynyň DNK bilen baglaýjy makromolekulalarynda we ellik we plastmassa ýaly laboratoriýa enjamlarynda tapyp bilersiňiz. Gazlandyrylanda ýa-da ondan soň nuklein kislotalaryny arassalamak PCR inhibitorlaryny aýyrmak üçin ileri tutulýan usuldyr.
Häzirki wagtda dürli awtomatiki gazyp almak enjamlary köp sanly protokollaryň ornuny tutup biler, ýöne 100% dikeltmek we / ýa-da nyşanlary arassalamak hiç wagt gazanylmady. Potensial ingibitorlar arassalanan nuklein kislotalarynda henizem bolup biler ýa-da güýje giren bolmagy mümkin. Inhibitorlaryň täsirini azaltmak üçin dürli strategiýalar bar. Degişli polimerazyň saýlanylmagy inhibitoryň işjeňligine ep-esli täsir edip biler. PCR inhibisiýasyny azaltmak üçin beýleki subut edilen usullar polimeraza konsentrasiýasyny ýokarlandyrmak ýa-da BSA ýaly goşundylary ulanmakdyr.
PCR reaksiýalarynyň gadagan edilmegi, içerki prosesiň hiline gözegçilik (IPC) ulanmak arkaly görkezilip bilner.
Çekiş toplumynda etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol we fenol ýaly ähli reagentleri we beýleki çözgütleri düýpli ýuwmak ädimi bilen nuklein kislotasyndan aýyrmak üçin seresap bolmaly. Konsentrasiýasyna baglylykda PCR-i işjeňleşdirip ýa-da saklap bilerler.