PCR reaksiýalarynda interferensiýa faktorlary

PCR reaksiýasy wagtynda käbir päsgelçilik döredýän faktorlar köplenç duş gelýär.
PCR-iň örän ýokary duýgurlygy sebäpli, hapalanma PCR netijelerine täsir edýän iň möhüm faktorlaryň biri hasaplanýar we ýalan oňyn netijeleri berip biler.
Ýalňyş-negatiw netijeleriň berilmegine sebäp bolýan dürli çeşmeler hem şeýle möhümdir. Eger PCR garyndysynyň bir ýa-da birnäçe möhüm bölegi ýa-da güýçlendirme reaksiýasynyň özi päsgel berilse ýa-da päsgel berilse, diagnostik synagyň geçirilmegine päsgel berlip bilner. Bu bolsa netijeliligiň peselmegine we hatda ýalan-negatiw netijeleriň bolmagyna getirip biler.
Tormozlamadan başga-da, nusgany taýýarlamazdan öň daşamak we/ýa-da saklamak şertleri sebäpli nyşana nuklein kislotasynyň bitewüliginiň ýitmegi mümkin. Hususan-da, ýokary temperatura ýa-da ýeterlik derejede saklamazlyk öýjükleriň we nuklein kislotalarynyň zeperlenmegine getirip biler. Öýjükleriň we dokumalaryň fiksasiýa edilmegi we parafinleriň ýerleşdirilmegi DNK-nyň parçalanmagynyň belli sebäpleridir we dowamly meseledir (1-nji we 2-nji suratlara serediň). Bu ýagdaýlarda, hatda iň gowy izolýasiýa we arassalamak hem kömek etmez.

1-nji surat | Immobilizasiýanyň DNK bitewüligine täsiri
Agaroza gel elektroforezi awtopsiýalaryň parafin böleklerinden bölünip alnan DNK-nyň hiliniň düýpli üýtgeýändigini görkezdi. Fiksasiýa usulyna baglylykda ekstraktlarda dürli ortaça bölek uzynlyklaryndaky DNK bardy. DNK diňe ýerli doňdurylan nusgalarda we buferlenen neýtral formalinde fiksirlenende saklanyp galdy. Güýçli kislotaly Buin fiksatorynyň ýa-da buferlenmeýän, formik kislota saklaýan formaliniň ulanylmagy DNK-nyň düýpli ýitmegine getirdi. Galan bölek ýokary derejede böleklenen.
Çep tarapda, bölekleriň uzynlygy kilobaza jübütlerinde (kbp) görkezilýär.

2-nji surat | Nuklein kislotasynyň nyşanalarynyň bitewüliginiň ýitmegi
(a) Iki zynjyrdaky 3′-5′ aralyk nyşana DNK-nyň döwülmegine sebäp bolar. DNK-nyň sintezi kiçi bölekde dowam eder. Şeýle-de bolsa, eger DNK böleginde praýmeriň ýumşadylan ýeri ýok bolsa, diňe çyzykly güýçlendirme bolýar. Iň amatly ýagdaýda, bölekler biri-birini gaýtadan doýup bilerler, ýöne hasyl az we anyklaýyş derejesinden aşak bolar.
(b) Esasan hem depurinasiýa we timidin dimeriniň emele gelmegi sebäpli esaslaryň ýitmegi H-baglanyşyklarynyň sanynyň azalmagyna we Tm-iň azalmagyna getirýär. Uzak wagtlap dowam edýän gyzdyryş tapgyrynda primerler matrisa DNK-syndan ereýär we has berk bolmadyk şertlerde hem gyzdyrylmaýar.
(c) Ýanynda ýerleşýän timin esaslary TT dimerini emele getirýär.
Molekulýar diagnostikada köplenç ýüze çykýan başga bir umumy mesele, fenol-hloroform ekstraksiýasy bilen deňeşdirilende, nyşana nuklein kislotalarynyň optimal derejede az bölünip çykmagydyr. Iň adatdan daşary ýagdaýlarda, bu ýalňyş negatiw netijeler bilen baglanyşykly bolup biler. Gaýnadylan lizis ýa-da öýjük galyndylarynyň fermentatiw siňdirilmegi arkaly köp wagt tygşytlanyp bilner, ýöne bu usul köplenç nuklein kislotasynyň ýeterlik derejede bölünip çykmazlygy sebäpli PCR duýgurlygynyň pes bolmagyna getirýär.

Güýçlendirme wagtynda polimeraza işjeňliginiň basylyp saklanmagy

Umuman, inhibisiýa PCR netijeleriniň pes bolmagyna getirýän ähli faktorlary beýan etmek üçin konteýner düşünjesi hökmünde ulanylýar. Diňe biohimiki manyda, inhibisiýa fermentiň işjeňligi bilen çäklenýär, ýagny DNK polimerazasynyň işjeň merkezi ýa-da onuň kofaktory (meselem, Taq DNK polimerazasy üçin Mg2+) bilen özara täsirleşmek arkaly substrat-önümiň öwrülmegini azaldýar ýa-da öňüni alýar.
Nusgadaky komponentler ýa-da reagentleri öz içine alýan dürli buferler we ekstraktlar fermenti gönüden-göni basyp ýa-da onuň kofaktorlaryny (meselem, EDTA) tutup, polimerazany işjeňsizleşdirip, öz gezeginde PCR netijeleriniň peselmegine ýa-da ýalňyş negatiw bolmagyna getirip biler.
Şeýle-de bolsa, reaksiýa komponentleri bilen nyşana eýe bolan nuklein kislotalarynyň arasyndaky köp özara täsirler "PCR ingibitorlary" diýlip hem atlandyrylýar. Öýjükleriň bitewüligi izolýasiýa arkaly bozulandan we nuklein kislotasy bölünip çykandan soň, nusga bilen onuň töweregindäki ergin we gaty fazanyň arasynda özara täsirler ýüze çykyp biler. Mysal üçin, "hassar edijiler" kowalent däl özara täsirler arkaly bir ýa-da iki zynjyrly DNK-ny baglap, ahyrsoňy PCR reaksiýa damaryna ýetýän nyşanalaryň sanyny azaltmak arkaly izolýasiýa we arassalamaga päsgel berip bilerler.
Umuman, PZR ingibitorlary beden suwuklyklarynyň köpüsinde we kliniki diagnostika barlaglary üçin ulanylýan reagentlerde (siýdikde moçewina, ganda gemoglobin we geparin), iýmit goşundylarynda (organiki komponentler, glikogen, ýag, Ca2+ ionlary) we daşky gurşawdaky komponentlerde (fenollar, agyr metallar) bar.

Has köp ýaýran PZR ingibitorlaryny bakteriýalarda we eukaryotik öýjüklerde, nyşana alynmadyk DNK-da, dokuma matrisalarynyň DNK-ny baglaýjy makromolekulalarynda we ellikler we plastmassalar ýaly laboratoriýa enjamlarynda tapyp bolýar. PZR ingibitorlaryny aýyrmak üçin ekstraksiýa wagtynda ýa-da ondan soň nuklein kislotalaryny arassalamak iň gowy usuldyr.
Häzirki wagtda dürli awtomatlaşdyrylan ekstraksiýa enjamlary köp sanly el bilen işleýän protokollaryň ornuny tutup biler, ýöne nyşanalary 100% dikeltmek we/ýa-da arassalamak hiç haçan gazanylmady. Potensial ingibitorlar arassalanan nuklein kislotalarynda henizem bolup biler ýa-da eýýäm güýje giren bolmagy mümkin. Inhibitorylaryň täsirini azaltmak üçin dürli strategiýalar bar. Degişli polimerazany saýlamak ingibitoryň işjeňligine uly täsir edip biler. PCR ingibisiýasyny azaltmak üçin beýleki subut edilen usullar polimerazanyň konsentrasiýasyny ýokarlandyrmak ýa-da BSA ýaly goşundylar ulanmakdyr.
PCR reaksiýalarynyň basylyp saklanmagyny içki prosesleriň hilini gözegçilikde saklamak (IPC) usuly arkaly görkezmek bolar.
Ekstraksiya toplumyndaky ähli reagentleri we etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol we fenol ýaly erginleri nuklein kislotasynyň izolýatyndan düýpli ýuwmak ädimi bilen aýyrmak üçin seresap bolmaly. Konsentrasiýasyna baglylykda, olar PCR-i işjeňleşdirip ýa-da basyp bilýärler.